Dobór metody identyfikacji zaczyna się od pytania, co znajduje się w ręku: czysty izolat, mieszanina, materiał bez wzrostu czy sam sygnał molekularny. MALDI-TOF świetnie identyfikuje wiele izolatów reprezentowanych w bibliotece, ale nie opisze całej mieszanej próbki. PCR szybko wykrywa znany cel, lecz nie znajdzie organizmu spoza panelu. Sekwencjonowanie rozszerza zakres, a jednocześnie zwiększa zależność od kontroli, baz i interpretacji.

Drzewo proponuje ścieżkę pierwszą, potwierdzenie i wynik, którego metoda nie dostarcza. Nie służy do samodzielnej diagnozy pacjenta. W materiale klinicznym wybór próbki i pytanie kliniczne poprzedzają technologię; IDSA i ASM podkreślają ścisłą współpracę lekarza z laboratorium oraz dobór testu do zespołu, próbki i czasu.idsa-asm

Przejdź do kalkulatora

Identyfikacja nie zaczyna się od instrumentu

Pierwsze pytanie brzmi: jaki wynik zmieni decyzję? Rozpoznanie zakażenia, zwolnienie produktu, opis społeczności i porównanie izolatów wymagają innych poziomów dowodu. Nazwa gatunku może być zbędna, gdy decyzję określa gen toksyny, i niewystarczająca, gdy trzeba wykazać transmisję w ognisku.

Drugie pytanie dotyczy próbki. Kontaminacja materiału, opóźnienie transportu i wcześniejsze leczenie mogą zdeterminować wynik bardziej niż platforma. Od pytania klinicznego do właściwej próbki rozwija etap przedanalityczny.

Trzecie pytanie: czy potrzebny jest żywy izolat? Test molekularny może szybko wykryć cel, ale bez izolatu nie wykonuje się klasycznego AST, nie zachowuje szczepu i nie potwierdza każdej cechy fenotypowej.

Czysty izolat otwiera ścieżkę fenotypową i MALDI-TOF

Morfologia i testy podstawowe

Wygląd kolonii, barwienie, kształt, katalaza, oksydaza i inne reakcje pomagają sprawdzić czystość oraz dobrać bibliotekę. Nie powinny służyć jako końcowa identyfikacja, gdy gatunki mają nakładające się fenotypy.

Niespójność między morfologią a wynikiem automatu jest sygnałem do sprawdzenia mieszaniny, wieku kultury, podłoża i bazy. „Aparat wydał nazwę” nie usuwa biologicznej kontroli sensowności.

MALDI-TOF

MALDI-TOF tworzy profil białkowy izolatu i porównuje go z biblioteką. Jest szybki, ma niski koszt marginalny i dobrą wydajność dla wielu rutynowych bakterii oraz drożdży. Wymaga jednak reprezentacji organizmu, prawidłowego przygotowania, kalibracji i odpowiedniego progu.

Niska jakość widma może wynikać z mieszaniny, matrycy, kolonii, ekstrakcji albo rzadkiego taksonu. Powtórzenie tego samego słabego przygotowania nie dodaje niezależnego dowodu.

Niektóre blisko spokrewnione gatunki lub kompleksy są nierozróżnialne na poziomie biblioteki. Wtedy poprawnym wynikiem może być kompleks, a nie wymuszona nazwa gatunkowa. CDC MicrobeNet przyjmuje widma MALDI oraz sekwencje 16S i ITS do identyfikacji rzadkich bakterii i grzybów, co pokazuje rolę rozszerzonej ścieżki referencyjnej.microbenet

MALDI-TOF w identyfikacji mikroorganizmów opisuje mechanizm, a MALDI-TOF: Bruker MALDI Biotyper sirius i bioMérieux VITEK MS PRIME platformy.

Systemy biochemiczne

Panel substratów identyfikuje izolat przez wzór reakcji i bazę prawdopodobieństwa. Jest użyteczny, gdy MALDI nie jest dostępny, jako metoda uzupełniająca albo przy pytaniu o funkcję fenotypową.

Wynik zależy od czystego i standaryzowanego inokulum, temperatury, czasu oraz ekspresji. Nietypowy szczep może wypaść poza profil. Automatyczne reguły nie zastępują kontroli morfologii.

Sekwencja genu markerowego jako ścieżka dla niejasnego izolatu

16S rRNA dla bakterii

Sekwencjonowanie genu 16S rRNA pomaga identyfikować bakterie, gdy MALDI lub fenotyp nie dają wiarygodnej nazwy. Jakość zależy od długości i jakości sekwencji, liczby kopii, regionu, bazy oraz kryteriów podobieństwa.

16S nie rozdziela wszystkich bliskich gatunków. Kilka gatunków może mieć identyczną lub niemal identyczną sekwencję w analizowanym regionie. Wynik „najlepsze trafienie 99,8%” nie dowodzi gatunku, jeśli kolejne taksony mają taki sam wynik.

Mieszanina izolatu daje nakładające się piki Sangera. Przed interpretacją trzeba wrócić do czystości albo użyć metody zdolnej rozdzielić składniki.

ITS dla grzybów

Region ITS jest podstawowym markerem wielu grzybów. Dla drożdży i pleśni jakość bazy, pełna sekwencja i nomenklatura są kluczowe. Niektóre kompleksy wymagają dodatkowych loci, a sekwencja z materiału mieszanego może zawierać kilka szablonów.

Morfologia pleśni nadal wnosi informację i pomaga wykryć kontaminację. Wynik molekularny powinien być zgodny z zakresem walidacji.

Dodatkowe loci

Gdy marker uniwersalny nie rozdziela grupy, właściwe może być locus specyficzne, sekwencjonowanie wielolokusowe albo genom. Dobór zależy od taksonu; nie ma jednego genu „drugiego wyboru” dla wszystkich bakterii i grzybów.

Praktyczne wytyczne ASM wskazują, że 16S pozostaje użyteczne po nierozstrzygającym MALDI, ale bliskie kompleksy mogą wymagać innych genów.asm-16s

Genom całego izolatu daje rozdzielczość, ale wymaga ramy porównania

WGS może potwierdzić takson, wykryć geny i porównać pokrewieństwo. ANI pomaga w klasyfikacji gatunkowej, a analiza wariantów lub cgMLST w dochodzeniu epidemiologicznym.

„Ten sam gatunek” nie oznacza transmisji, a mała liczba różnic nie ma uniwersalnego progu. Tempo ewolucji, rekombinacja, czas, różnorodność w gospodarzu i jakość danych wpływają na interpretację. Potrzebna jest epidemiologia i odpowiedni zestaw porównawczy.

Gen oporności przewiduje potencjał, nie zawsze fenotyp. Brak znanego genu nie dowodzi wrażliwości. WGS nie zastępuje AST, jeśli decyzja opiera się na fenotypie.

Sekwencjonowanie w diagnostyce i dochodzeniu epidemiologicznym rozwija ograniczenia.

Próbka mieszana z konkretnym podejrzeniem

PCR/qPCR/dPCR

Test ukierunkowany szybko wykrywa znaną sekwencję. qPCR dostarcza sygnał ilościowy po odpowiedniej kalibracji, a dPCR estymuje kopie przez partycjonowanie. Swoistość zależy od starterów, sondy i bazy wariantów.

Wykryte DNA lub RNA nie zawsze oznacza żywy organizm albo przyczynę. Materiał może utrzymywać się po leczeniu, pochodzić z kolonizacji lub kontaminacji. Wartość Cq nie jest uniwersalną liczbą komórek.

Kontrola ekstrakcji, inhibicji, dodatnia, ujemna i kontrola kontaminacji są częścią wyniku. PCR, qPCR i diagnostyka syndromowa opisuje interpretację.

Panel syndromowy

Panel testuje zamkniętą listę celów dopasowaną do zespołu klinicznego. Zaletą jest czas i standaryzacja, ograniczeniem brak organizmów spoza panelu, wspólne wykrycie wielu celów oraz trudność odróżnienia kolonizacji.

Negatywny panel nie jest „ujemną mikrobiologią”. Raport musi wskazywać listę celów. Dodatni wynik może wymagać hodowli dla AST, epidemiologii lub potwierdzenia.

Antygen i mikroskopia

Test antygenowy może szybko wykryć składnik organizmu bez amplifikacji, a mikroskopia ujawnić morfologię w próbce. Obie metody mają czułość zależną od obciążenia i materiału. Wynik ujemny przy małej liczbie nie wyklucza celu.

Ich wartość jest największa, gdy wynik odpowiada konkretnemu pytaniu i ma znane cechy w tej próbce.

Próbka mieszana bez konkretnego celu

Amplicon 16S/ITS

Sekwencjonowanie amplikonu opisuje względny skład bakterii/archeonów albo grzybów na poziomie zależnym od regionu i bazy. Jest użyteczne dla społeczności, ale nie jest pełną identyfikacją każdego organizmu.

Startery mają bias, liczba kopii markera różni się między taksonami, a udział odczytów nie jest udziałem komórek. Zanieczyszczenia zestawu dominują w próbkach o małej biomasie.

Nie wykryje wirusów niezawierających markera ani funkcji poza słabą predykcją. Do liczby bezwzględnej potrzebny jest spike-in, całkowita liczba lub inna kalibracja.

Shotgun metagenomics

Metagenomika shotgun sekwencjonuje szeroki zakres DNA i może wykrywać taksony oraz geny. Zakres zależy od głębokości, stosunku DNA gospodarza, ekstrakcji i bazy. Rzadki organizm może pozostać niewykryty wśród dominującego tła.

Kontaminacja laboratoryjna, indeksowa i bazowa może tworzyć fałszywe przypisania. Wynik taksonomiczny powinien opierać się na wielu niezależnych fragmentach, pokryciu i kontroli, nie jednym odczycie.

W materiale klinicznym metagenomika agnostyczna wymaga specjalistycznego laboratorium i interpretacji względem obrazu klinicznego. Nie jest domyślnym testem przesiewowym każdej próbki.

Metatranskryptomika

RNA może przybliżać aktywność i wspierać wykrywanie wirusów RNA, ale jest labilne, zależne od przygotowania i ekspresji. Obecność transkryptu nie dowodzi kompletnego cyklu ani etiologii.

Brak wzrostu nie kończy identyfikacji

Brak kolonii może wynikać z wcześniejszego leczenia, transportu, niewłaściwego podłoża, tlenu, temperatury, małej liczby lub niehodowalności. Najpierw trzeba sprawdzić etap przedanalityczny i kontrolę procesu.

Jeśli cel jest znany, ukierunkowany NAAT lub antygen może być właściwy. Jeśli pytanie jest otwarte i znaczenie wyniku duże, możliwe są marker uniwersalny z materiału, mNGS, mikroskopia specjalna albo laboratorium referencyjne.

Sekwencja z próbki bez izolatu nie dostarcza żywego materiału. Nie wykonuje klasycznego AST i może nie rozdzielić kilku bliskich organizmów w mieszaninie.

Wirusy wymagają innej gałęzi

Rutynowe bakteryjne MALDI-TOF z kolonii nie identyfikuje wirusa z próbki. Hodowla wirusowa wymaga odpowiednich komórek i infrastruktury, jest wolna i nie zawsze dostępna. Główne ścieżki to NAAT, antygen, serologia w odpowiednim oknie i sekwencjonowanie.

PCR dodatni wykrywa kwas nukleinowy. Antygen może lepiej korelować z dużym obciążeniem, ale ma inną czułość. Serologia wykrywa odpowiedź gospodarza i zależy od czasu oraz odporności.

Sekwencjonowanie genomu wirusa służy klasyfikacji i epidemiologii, a nie automatycznie ocenie zakaźności. Budowa wirionu i typy genomów wirusowych pokazuje, dlaczego jedna procedura ekstrakcji nie pasuje do wszystkich.

Pasożyty i protisty

Mikroskopia, antygen, PCR i serologia mają różną rolę zależnie od organizmu, stadium i materiału. Jajo, cysta, trofozoit i DNA nie są wymienne. Koncentracja próbki może być ważniejsza niż kolejna platforma.

Morfologia wymaga kompetencji i materiału referencyjnego. PCR jest czuły dla celu, ale panel nie obejmuje wszystkiego. W trudnym przypadku właściwe jest laboratorium referencyjne.

Potrzebna funkcja: nazwa gatunku może nie wystarczyć

Oporność, toksyna i zdolność metaboliczna mogą być obecne tylko w części szczepów. PCR genu szybko wykrywa marker, ale nie dowodzi ekspresji ani lokalizacji w żywym izolacie. Fenotyp pokazuje działanie w warunkach testu, lecz może nie ujawnić mechanizmu.

Najmocniejsza ścieżka łączy nazwę, marker i fenotyp odpowiednio do decyzji. Przykładowo gen oporności może przyspieszyć reakcję, a AST pozostać podstawą pełnego profilu.

System automatyczny raportujący identyfikację i AST wykonuje dwie odrębne analizy. Automaty identyfikacji i AST: VITEK 2 Compact, BD Phoenix M50 i MicroScan WalkAway opisuje ich powiązanie.

Rozdzielczość rodzaju, gatunku, szczepu i funkcji

Poziom Typowe pytanie Przykładowa ścieżka Ograniczenie
grupa/rodzaj jaki szeroki typ jest obecny? barwienie, MALDI, marker może wystarczyć do decyzji wstępnej
gatunek/kompleks jaka jednostka taksonomiczna? MALDI, 16S/ITS, loci bliskie taksony mogą pozostać kompleksem
szczep czy izolaty są blisko spokrewnione? WGS/cgMLST/SNP próg zależy od organizmu i kontekstu
funkcja czy jest gen/toksyna/fenotyp? PCR, WGS, test fenotypowy gen nie zawsze równa się ekspresji
społeczność kto jest w mieszaninie? amplicon/shotgun względność, bias i baza

Wybór metody o zbyt wysokiej nominalnej rozdzielczości nie gwarantuje lepszego wniosku. WGS słabej jakości bez odpowiedniego tła porównawczego może być mniej użyteczne niż poprawny wynik kompleksu.

Baza danych jest częścią metody

MALDI, 16S, ITS i metagenomika opierają się na bazach. Błędnie oznaczony rekord, stara nomenklatura lub brak rzadkiego taksonu zmienia wynik. Należy zapisać nazwę i wersję bazy.

Najlepsze trafienie nie jest dowodem, jeśli pokrycie jest małe albo kilka rekordów ma podobny wynik. Kuracja i źródło sekwencji są ważniejsze niż sama liczba rekordów.

Zmiana bazy może zmienić identyfikację bez zmiany próbki. Aktualizacja wymaga weryfikacji na reprezentatywnych organizmach i oceny wyników historycznych.

Czystość izolatu jest warunkiem wielu metod

Pojedynczy morfotyp nie gwarantuje czystości. Dwie bakterie mogą tworzyć podobne kolonie. MALDI może dać niską jakość lub profil dominującego składnika, panel biochemiczny mieszaną reakcję, a Sanger nakładające się piki.

Dowód czystości łączy morfologię, mikroskopię, zgodność subkultury i sygnał metody. Izolowanie kolonii a dowód czystości kultury rozwija kryteria.

Nietypowy lub ryzykowny izolat powinien zatrzymać rutynową ścieżkę

Nieznany izolat nie jest bezpieczny tylko dlatego, że wyrósł na zwykłym podłożu. Morfologia, brak identyfikacji, nietypowa hemoliza, zapach lub profil mogą wymagać ograniczenia manipulacji i kontaktu z laboratorium referencyjnym.

Drzewo zwraca bramkę bezpieczeństwa, gdy zaznaczono podwyższone ryzyko. Nie proponuje dalszych testów na stole. Dlaczego nieznany izolat nie jest automatycznie bezpieczny wyjaśnia ocenę ryzyka.

Wynik z wielu metod: zgodność i konflikt

Zgodne MALDI, fenotyp i marker zwiększają pewność, jeśli błędy są niezależne. Dwie metody korzystające z tej samej błędnej bazy nie są w pełni niezależne.

Konflikt powinien uruchomić kontrolę czystości, etykiety, jakości, zakresu biblioteki i taksonomii. Nie należy wybierać wyniku bardziej szczegółowego tylko dlatego, że wygląda nowocześnie.

Raport może uczciwie zakończyć się na rodzaju lub kompleksie. Nadmierna specyficzność jest błędem, gdy metoda nie rozdziela taksonów.

Kontrole dla ścieżki molekularnej

Minimalny zestaw zależy od metody, ale obejmuje:

  • kontrolę pobrania lub materiału, jeśli możliwa;
  • kontrolę ekstrakcji;
  • kontrolę dodatnią celu;
  • kontrolę bez matrycy;
  • kontrolę inhibicji wewnętrzną;
  • rozdzielenie stref przed i po amplifikacji;
  • kontrolę kontaminacji odczynników przy małej biomasie;
  • kryteria jakości sekwencji i pokrycia.

Brak sygnału kontroli wewnętrznej nie jest ujemnym wynikiem celu. Jest wynikiem nieważnym lub wymagającym procedury naprawczej.

Czułość analityczna i kliniczna to różne rzeczy

Test może wykrywać kilka kopii w buforze, a mieć niską czułość w próbce z inhibitorami lub złym pobraniem. Wysoka czułość molekularna może wykrywać kolonizację bez związku z chorobą.

Czułość analityczna, kliniczna, swoistość i wartość predykcyjna pokazuje, dlaczego wynik zależy od populacji i pytania.

Czas do wyniku i czas do decyzji

Szybki PCR może dać wynik w godzinę, ale jeśli nie obejmuje celu, ścieżka kończy się później. Hodowla trwa dłużej, lecz dostarcza izolatu i AST. MALDI jest szybkie po uzyskaniu kolonii, a czas całkowity obejmuje wzrost.

Należy liczyć czas od pobrania do użytecznej decyzji. Metoda referencyjna wysłana po trzech nieudanych powtórzeniach rutynowych jest wolniejsza niż wczesne rozpoznanie granicy platformy.

Koszt błędnej szczegółowości

Fałszywa identyfikacja rzadkiego patogenu może uruchomić niewłaściwe leczenie, alarm lub dochodzenie. W środowisku błędna nazwa może wypaczyć wniosek ekologiczny. Koszt potwierdzenia trzeba porównać z kosztem błędu.

Jeśli wynik jest nieoczekiwany i istotny, próg potwierdzenia powinien być wyższy. Powtórzenie tą samą metodą kontroluje część błędów technicznych, ale niezależna metoda kontroluje inne założenie.

Minimalny raport identyfikacji

Raport powinien podać:

  • materiał i stan: próbka czy izolat;
  • metodę przygotowania i czystość;
  • platformę, bibliotekę/bazę i wersję;
  • poziom identyfikacji oraz wynik surowy jakości;
  • taksony nierozróżnialne;
  • kontrolę i zakres walidacji;
  • metodę potwierdzającą;
  • znaczenie i ograniczenie wyniku;
  • status izolatu oraz dostępność do dalszych testów.

Przykład:

Czysty izolat zidentyfikowano MALDI-TOF do poziomu kompleksu; biblioteka nie rozdzielała dwóch gatunków. Powtórna ekstrakcja dała zgodny profil. Sekwencja 16S również nie rozdzieliła kompleksu, dlatego raport nie przypisał gatunku. Dla decyzji klinicznej wykonano fenotypowe AST, a izolat przekazano do laboratorium referencyjnego z powodu nietypowego profilu.

Najczęstsze błędy w drzewie

Najczęstszy błąd to wybór metody przed ustaleniem próbki. Kolejne to użycie MALDI dla mieszaniny, PCR bez jawnej listy celów, 16S jako uniwersalnego rozdzielacza gatunków i WGS jako dowodu transmisji bez epidemiologii.

Inne pułapki:

  • brak kontroli czystości izolatu;
  • utożsamienie wykrycia DNA z żywotnością;
  • raportowanie udziału odczytów jako liczby komórek;
  • brak wersji bazy;
  • wymuszenie nazwy przy równych trafieniach;
  • pominięcie organizmów spoza panelu;
  • brak izolatu przy potrzebie AST;
  • kontynuowanie pracy z nietypowym izolatem bez oceny ryzyka.

Powiązane artykuły

Posiew, kultura czysta i identyfikacja fenotypowa, Testy biochemiczne i systemy automatyczne oraz Sekwencjonowanie w diagnostyce i dochodzeniu epidemiologicznym rozwijają trzy główne gałęzie.

Źródła i dalsza lektura

Drzewo opracowano z rozdziałów diagnostycznych książek Mikrobiologia lekarska, Mikrobiologia lekarska, tom 1–2, Mikrobiologia i Podstawy mikrobiologii i epidemiologii szpitalnej, zakupionych z licencją do wykorzystania wiedzy. Aktualną praktykę zweryfikowano w przewodniku IDSA/ASM oraz materiałach CDC MicrobeNet.